免疫熒光六標七色掃描分析全套（切片）

服務(wù)介紹：

免疫熒光六標即利用酪胺信號放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技術(shù)，在同一張切片上對六種蛋白同時進行標記，從而可實現(xiàn)對多種蛋白空間定位，定性及半定量分析。

TSA技術(shù)主要原理為熒光標記的酪胺在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街诎袠酥車牡鞍桌?氨酸殘基上，此結(jié)合是共價結(jié)合。而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結(jié)合。通過微波處理，非共價結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉，而共價結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，將靶標通過熒光標記顯示出來。在檢測第二個靶標時，相當于全新的一輪標記，無需考慮第二輪的抗體是否與第一輪的抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)。只需改變不同種類熒光染料標記TSA即可實現(xiàn)多個靶標的標記。通過多次重復(fù)免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)雙重或多重熒光染色

掃描的熒光圖像可以用軟件對陽性信號進行半定量分析，用數(shù)據(jù)去評價陽性的強弱。對于陽性為單個細胞表達的指標可以做陽性細胞相關(guān)參數(shù)的分析，對于陽性為成片表達的指標可以做陽性面積相關(guān)參數(shù)的分析。陽性細胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)包含：各指標陽性細胞比率、陽性細胞密度、陽性強度。一次分析即可獲取各指標陽性細胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)的三個數(shù)值。陽性細胞數(shù)量相關(guān)參數(shù)均可用于評價陽性強弱多少，可根據(jù)需求進行選擇應(yīng)用。陽性面積相關(guān)參數(shù)包含：陽性面積比，陽性強度。一次分析即可獲取各指標陽性面積相關(guān)參數(shù)的兩個數(shù)值。陽性面積相關(guān)參數(shù)均可用于評價陽性強弱多少，可根據(jù)需求進行選擇應(yīng)用。

送樣運輸要求：

1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運輸石蠟包埋切片。切勿冷凍結(jié)冰，切勿固定時間過長。

2、石蠟切片常溫保存運輸。

3、熒光六標只能做石蠟包埋切片，不能做冰凍切片和細胞爬片。

實驗大體流程：

石蠟切片脫蠟至水——微波抗原修復(fù)——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第三種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF546-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第四種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF594-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第五種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第六種一抗——孵育HRP二抗孵育iF700-TSA——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像——數(shù)據(jù)分析。

實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

6、加對應(yīng)種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF440-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF440-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

8、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

9、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

11、加對應(yīng)種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

13、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

14、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

15、加第三種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

16、對應(yīng)的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

17、加iF546-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF546-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

18、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

19、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉），一抗其它來源的用3%BSA封閉。

20、加第四種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

21、對應(yīng)的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

22、加iF594-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF594-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

23、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

24、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

25、加第五種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

26、對應(yīng)的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

27、加iF647-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF647-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

28、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。

29、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

30、加第六種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

31、對應(yīng)的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

32、加iF700-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF700-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

33、DAPI復(fù)染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

34、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

35、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

36、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。

37、數(shù)據(jù)分析：用軟件對陽性細胞數(shù)量或陽性面積進行分析，得到陽性細胞比率、陽性細胞密度、陽性強度或陽性面積比和陽性強度。